Jornal Internacional de Pesquisa Cardiovascular

Utilização de Na3PO4 para melhorar modelos animais in vitro de calcificação da válvula aórtica

Daniel Alejandro Lerman, Sai Prasad e Nasri Alotti

Utilização de Na ₃ PO ₄ para melhorar modelos animais in vitro de calcificação da válvula aórtica

Justificação/Objetivos: A patogénese da doença valvular aórtica calcificada (CAVD) envolve um processo inflamatório ativo das células intersticiais valvulares (VICs) caracterizado pela ativação de vias de sinalização osteogénica específicas e apoptose. Este processo pode ser estudado através da análise de determinados marcadores moleculares e vias de expressão génica de calcificação espontânea. O objetivo do nosso estudo é investigar o papel do fosfato de sódio (Na ₃ PO ₄ ) como promotor da calcificação, com o objetivo de melhorar os modelos animais in vitro para testar potenciais inibidores da calcificação.

Materiais e Métodos: Os VICs foram extraídos de 6 corações de porco frescos, saudáveis, com 6 meses de idade, por digestão em série com colagenase. A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) foi utilizada para quantificar a transdiferenciação dos genes de interesse durante a calcificação espontânea dos VICs. A calcificação espontânea dos VICs foi aumentada pela adição de Na ₃ PO ₄ (3 mM, pH 7,4). O grau de calcificação foi estimado pela coloração com Alizarin Red para a deposição de cálcio e Sirius Red para o colagénio. Foram utilizadas técnicas colorimétricas para determinar quantitativamente a deposição de cálcio e colagénio. Além disso, a atividade enzimática da fosfatase alcalina (ALP) foi medida por um ensaio cinético. Para a análise estatística foram utilizados o SPSS e o Microsoft Office Excel 2013.

Resultados: Os VICs suínos calcificam espontaneamente com deposição demonstrável de cálcio e colagénio. Neste estudo observámos um aumento da deposição de cálcio e colagénio do dia 0 ao dia 14 (cálcio: 376%; P<0,001, colagénio: 3553%; P<0,001). A análise qPCR do mRNA no dia 14 mostrou os seguintes resultados: a α-actina, um marcador do fenótipo dos mioblastos, aumentou para 1,6 vezes; P<0,001. O Runx2, um marcador de osteoblastos, aumentou 1,3 vezes; P<0,05, o TGF-β, um promotor da osteogénese, aumentou para 3,2 vezes; P<0,001, e RhoA, um regulador da formação nodular nos mioblastos, aumentou para 4,5 vezes; P<0,001, em comparação com os seus níveis no dia 0. O ARNm de RANKL e a calponina não se alteraram significativamente. O tratamento dos VICs de porco com Na ₃ PO ₄ (3 mM, pH 7,4) levou a um aumento acentuado da deposição de cálcio no dia 14 (522%; P<0,001), e a um aumento significativo da atividade da ALP no dia 7 (228%; P<0,05). Não se verificaram alterações significativas na atividade da ALP entre os grupos no dia 14.

Conclusão: Este estudo demonstrou a sobre-regulação de algumas moléculas específicas durante a calcificação espontânea de VICs aórticas com um aumento ativo da atividade de cálcio, colagénio e ALP. Neste modelo in vitro foi possível aumentar a calcificação espontânea dos VICs com Na ₃ PO ₄ (3 mM, pH 7,4) até um nível em que os inibidores da calcificação puderam ser testados para identificar uma potencial nova estratégia terapêutica contra a estenose aórtica calcificada.